|
การวินิจฉัยไวรัสนิปาห์ห้องปฏิบัติการ |
|
|
|
Post by ดร.สุภาภรณ์ วัชรพฤษาดี
|
|
อังคาร, 19 ธันวาคม 2006 |
การวินิจฉัยไวรัสนิปาห์ห้องปฏิบัติการ PDF Download
ดร.สุภาภรณ์ วัชรพฤษาดี
คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
การวินิจฉัยโรคสมองอักเสบจากไวรัสนิปาห์ทางห้องปฏิบัติการ
แอนติบอดีย์ชนิด IgM ในคนไข้จะตรวจพบได้ในช่วงสั้นๆหลังจากมีไข้ โดยคนไข้เกือบทั้งหมดจะพบผลบวก IgM ในวันที่ 3 ของการมีไข้ ในช่วง 10 วันแรกของการป่วย นไข้ที่ติดเชื้อไวรัสนิปาห์มักจะพบระดับ IgG เพียง 10-29% และจะพบผลบวก 100 % หลังจากวันที่ 17-18 ของการป่วยไปแล้ว การตรวจวิเคราะห์ระดับ IgG และ IgM ต่อเชื้อไวรัสด้วยวิธี ELISA จะใช้แอนติเจนที่ไม่ติดเชื้อจาก inactivated virus หรือ recombinant DNA (อยู่ระหว่างการวิจัย) จึงทำให้มีความปลอดภัยในการตรวจและไม่จำเป็นต้องใช้ห้องปฏิบัติการ BSL 4 อย่างไรก็ตามการตรวจหาแอนติบอดีย์ IgM ยังสามารถตรวจได้ด้วยเทคนิค serum neutralization ซึ่งเป็นวิธีมาตรฐานและมีความจำเพาะในการตรวจสูงกว่าวิธี ELISA แต่มีความจำเป็นต้องปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติงาน BSL 4 เนื่องจาก ในการตรวจที่ใช้เป็นไวรัสที่ยังมีชีวิต เทคนิคการตรวจย้อมชิ้นเนื้อด้วยวิธี immunohistochemistry มีประโยชน์ในการย้อมชิ้นเนื้อที่แช่ฟอร์มาลิน การเพาะแยกเชื้อไวรัสโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง vero-E6 สามารถแยกเชื้อได้จากน้ำไขสันหลัง สิ่งคัดหลั่งจากโพรงจมูก (nasal samples), น้ำปัสสาวะ วิธีการตรวจทางอณูชีววิทยาด้วยเทคนิค RT-PCR มีการนำมาใช้ในการตรวจหาสารพันธุกรรมของไวรัส (RNA) จากตัวอย่างได้หลากหลายชนิดรวมทั้งชิ้นเนื้อต่างๆ โดยสรุปรายละเอียดแต่ละวิธีได้ดังนี้
1. การเพาะแยกเชื้อไวรัส (virus isolation)
ไวรัสนิปาห์จัดเป็นไวรัสที่มีความรุนแรงระดับสูงสุด (biosecurity level 4 ) การเพาะแยกเชื้อเพื่อเพิ่มปริมาณไวรัสต้องกระทำให้ห้องปฏิบัติการความปลอดภัยระดับ 4 (BSL4) เท่านั้น ยกเว้นแต่การเพาะแยกเชื้อเพื่อการวินิจฉัยที่อาจกระทำในห้องปฏิบัติการความปลอดภัยที่น้อยกว่าระดับ 4 โดยผู้ชำนาญการเฉพาะทาง และต้องทำลายเชื้อทันทีหลังการวินิจฉัย (Dariels et al Microbes and Infection, 2001) ไวรัสสามารถเพิ่มจำนวนได้ดีในเซลล์เพาะเลี้ยงชนิด vero calls
สิ่งส่งตรวจ ได้แก่ ชิ้นเนื้อสมอง ปอด ไต ม้าม น้ำไขสันหลัง น้ำปัสสาวะ nasal sample
วิธีการเก็บสิ่งส่งตรวจ เก็บแบบปลอดเชื้อ เพื่อนำมาเตรียม 10% cell suspensions ก่อน การเพาะเลี้ยง
วิธีการตรวจ หลังการเพาะเลี้ยงไวรัสในเซลเพาะเลี้ยง สามารถตรวจดูการติดเชื้อได้โดย
1) การตรวจดูภาวะ cytopathic effect (CPE) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ในเวลา 3 วัน แต่ ควรจะทำการเพาะเลี้ยง 2 รอบ (passage) ในเวลา 5 วัน/รอบ ก่อนการตัดสินผล ลบ CPE ที่พบจะมีขนาดใหญ่มากกว่า 20 nuclei ขึ้นไปและอาจพบรูบนผิวเซลล์เนื่องจาก การเกิดภาวะsyncytia โดยรูที่เกิดจากไวรัสนิปาห์จะมีขนาดใหญ่กว่าไวรัส Hendra
2) การย้อมเซลล์ที่มีการติดเชื้อด้วย antibody ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส
3) การทำ PCR จากตัวอย่าง ทั้งจากขวดเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัส
4) การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน หรือการย้อมด้วย antibody ก่อนการตรวจ
2. Immunohistochemistry
การตรวจแอนติเจน(antigen)ของไวรัสจากชิ้นเนื้อด้วยแอนติบอดีย์(antibody)ที่มีความจำเพาะ เป็นวิธีที่มีความปลอดภัยในการตรวจโดยไม่จำเป็นต้องปฏิบัติในห้อง BSL4 มีประโยชน์ทั้งในการวินิจฉัยและการศึกษาวิจัยย้อนหลัง
สิ่งส่งตรวจ ได้แก่ ชิ้นเนื้อแช่ฟอร์มาลิน จาก ปอด สมอง ม้าม ไต ต่อมน้ำเหลือง หัวใจ
วิธีเก็บสิ่งส่งตรวจ แช่ตัวอย่างในน้ำยาฟอร์มาลิน โดยจำนวนตัวอย่างควรมีมากกว่า 1 อวัยวะ เนื่องจากอาจจะพบแอนติเจนของไวรัสที่ปอดในระยะเวลาสั้นๆเท่านั้น ตัวอย่างจากเนื้อสมองควรทำการตรวจจากหลายส่วนของสมอง
วิธีการตรวจ หลังการย้อมชิ้นเนื้อด้วยแอนติบอดีย์ที่มีความจำเพาะ (monoclonal หรือ polyclonal) จึงย้อมซ้ำด้วยชุดย้อม biotin-streptavidin peroxidase linked detection system หรือ ชุดย้อม anti-rabbit/anti-mouse dextran polymer linked reagent conjugated with alkaline phosphatase
3. การตรวจวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน (Electron Microscopy)
เป็นเทคนิคต่อเนื่องจากการเพาะแยกเชื้อ โดยการตรวจด้วยเทคนิค negative contrast หรือการย้อมด้วยแอนติบอดีย์ที่มีความจำเพาะทำให้สามารถมองเห็นรูปร่างและโครงสร้างของไวรัสได้ชัดเจนยิ่งขึ้น
สิ่งส่งตรวจ น้ำจากเซลล์เพาะเลี้ยง, เซลล์เพาะเลี้ยง, ชิ้นเนื้อ
วิธีการเก็บสิ่งส่งตรวจ วิธีปลอดเชื้อ ในน้ำยาจำเพาะ
วิธีการตรวจ กล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน
4. อณูชีววิทยาด้วนเทคนิค PCR และ การถอดรหัสพันธุกรรม (Sequencing)
เป็นวิธีตรวจวัดโดยการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม RNA ของไวรัสด้วยเทคนิค RT-PCR และอาจทำการเพิ่มปริมาณ 2 รอบ ด้วยเทคนิค nested PCR เพื่อเพิ่มความไวในการตรวจ หรือการตรวจด้วยเทคนิค real-time-PCR ที่สามารถทราบผลการตรวจได้รวดเร็วกว่า (ใช้เวลาเพิ่มปริมาณและตรวจวัดสารพันธุกรรมได้ภายใน 1 ชั่วโมง) และมีความจำเพาะในการตรวจสูงจากการตรวจวัดด้วยตัวติดตาม (probe) ที่มีความจำเพาะต่อยีนที่ทำการเพิ่มปริมาณ ตำแหน่งยีนที่เลือกจะต้องมีความจำเพาะต่อไวรัสนิปาห์ ยีนที่นิยมใช้ คือ ยีนตำแหน่ง N (Nucleoprotein gene) การถอดรหัสพันธุกรรมทำให้สามารถจัดแยกกลุ่มของไวรัสและช่วยยืนยันผลการตรวจ
สิ่งส่งตรวจ ชิ้นเนื้อทุกชนิด, CSF, cell culture, น้ำเหลือง, ปัสสาวะ, throat swab, nasal swab.
วิธีการเก็บสิ่งส่งตรวจ ปลอดเชื้อ แช่เย็น
วิธีการตรวจ เทคนิค RT-PCR, nested PCR, real-time PCR และ Sequencing
5. การตรวจหา antibody ด้วยวิธี Serum Neutralization Tests
เป็นการตรวจหาปริมาณของ neutralizing antibody ในซีรั่ม และเป็นวิธีการมาตรฐานในการตรวจทาง serology แต่ต้องปฏิบัติการในห้อง BSL-4
สิ่งส่งตรวจ ซีรั่ม
วิธีการเก็บสิ่งส่งตรวจ วิธีปลอดเชื้อ
วิธีการตรวจ นำซีรั่มที่ต้องการตรวจมาผสมกับไวรัส ก่อนที่จะนำไปใส่ในเซลล์เพาะเลี้ยง เพื่อดูการติดเชื้อของไวรัสในเซลล์เพาะเลี้ยงภายในเวลา 3 วัน ตัวอย่างซีรั่มที่มีแอนติบอดีย์จะสามารถฆ่าเชื้อและไม่ทำให้เซลล์เพาะเลี้ยงติดเชื้อ แต่ถ้าในตัวอย่างซีรั่มที่ไม่มี neutralizing antibody อยู่ ก็จะไม่สามารถฆ่าเชื้อได้ในขั้นตอนแรกเซลล์เพาะเลี้ยงก็จะติดเชื้อ โดยสังเกตจากการเกิด CPE
6. การตรวจระดับ Antibody ด้วยวิธี ELISA
เป็นเทคนิคที่รวดเร็ว ปลอดภัยและไม่ต้องการห้องปฏิบัติการ BSL4 จึงเหมาะแก่การศึกษาระบาดวิทยา และการเฝ้าระวังโรค แต่ในขั้นตอนของการเตรียม Ag ซึ่งเป็นการนำไวรัสมาสกัดแยกโปรตีนและทำให้หมดฤทธิ์ด้วยการฉายรังสีนั้น ต้องปฏิบัติในห้อง BSL4 จึงมีข้อจำกัดในการนำมาใช้ในวงกว้าง โดยการตรวจสามารถตรวจได้ทั้ง แอนติบอดีย์แบบ IgG ด้วยวิธี Indirect ELISA และแบบ IgM ด้วยวิธี capture ELISA
สิ่งส่งตรวจ ซีรั่ม
วิธีเก็บสิ่งส่งตรวจ ปลอดเชื้อ
วิธีการตรวจ
- Indirect ELISA โดยการเคลือบ Ag ไว้ที่ก้นหลุม เพื่อให้แอนติบอดีย์ ในตัวอย่างจับแล้ว จึงตรวจวัดด้วย conjugated anti-human IgG
- Capture ELISA โดยการเคลือบ แอนติบอดีย์ ต่อ human IgM ไว้ที่ก้นหลุมก่อนในขั้นที่ 1 เพื่อจับ IgM จากซีรั่มในขั้นที่2 จากนั้นจึงเติมแอนติเจนNipah ในขั้นที่ 3 แล้วจึงเติม แอนติบอดีย์ต่อ Nipah Ag ในขั้นที่ 4 และตรวจวัดด้วย แอนติบอดีย์ conjugated anti- species ต่อ แอนติบอดีย์ ขั้นที่ 4
|
|
Last Updated ( อังคาร, 19 ธันวาคม 2006 )
|
.bmp "World Health Organization"){kind=small}
